TRƯỜNG ĐẠI HỌC
BUÔN MA THUỘT

Góc nhìn về chiến lược phát hiện và điều trị trúng đích SARS-CoV-2 (Kỳ II)

13/06/2020 0 0

 

  1. Chiến lược phát hiện SARS-CoV-2

Với tình trạng lây lan nhanh chóng và rộng khắp như hiện tại thì việc phát hiện, chẩn đoán nhanh là vô cùng cần thiết. Có nhiều phương pháp để phát hiện tác nhân virus xâm nhiễm vào cơ thể người như: Giải trình tự, PCR, Realtime PCR, LAMP, miễn dịch,… Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Theo khuyến cáo của WHO, Realtime PCR được xem là phương pháp chuẩn để phát hiện SARS-CoV-2 [4]. Trên cơ sở đó, các nước trên thế giới trong đó có Việt Nam đã và đang tạo ra các bộ kit dùng phương pháp Realtime PCR để chuẩn đoán nhanh và chính xác tác nhân virus này.

  1. Realtime PCR:

Kỹ thuật realtime PCR là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại phân tử DNA in vitro. Tuy nhiên, Realtime PCR khác phản ứng PCR thông thường ở chỗ nó có khả năng phát hiện và định lượng trực tiếp sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ của phản ứng. Phương pháp này đòi hỏi một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại.

Phòng để tiến hành chạy xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm cũng tuân thủ các điều kiện tương đối nghiêm ngặt. Đối với Realtime PCR, WHO khuyến cáo phải có mức độ an toàn sinh học cấp II, đảm bảo phòng tách vật liệu di truyền phải có áp lực âm [1].

Thành phần cơ bản để tiến hành phản ứng Realtime PCR phát hiện SARS-CoV-2 bao gồm:

  1. Mồi và các probe: Là yếu tố then chốt quyết định độ chính xác của xét nghiệm. Sau khi có kết quả giải trình tự SARS-CoV-2 [8], các nhà khoa học sẽ tiến hành tìm ra vùng đặc trưng cho SARS-CoV-2 và các virus có liên qua khác. Dựa trên các kết quả thử nghiệm và thực tê WHO đưa ra khuyến cáo cho các phòng thí nghiệm khác trên thế giới dựa vào và phát triển kit theo tiêu chuẩn WHO [4].
  2. Kit tách chiết vật liệu di truyền (RNA): Nồng độ RNA đầu vào của virus quan trọng trong việc phát hiện bằng phương pháp này. Kit tách RNA tốt sẽ nâng cao hiệu suất tách RNA từ mẫu bệnh phẩm cho kết quả chính xác hơn (tránh âm tính giả). Để kiểm soát quá trình tách chiết, người ta sẽ cho thêm một lượng RNA xác định vào mẫu bệnh phẩm và tách chung. Căn cứ kết quả thu được, người ta có thể kiểm soát được hiệu quả tách RNA từ mẫu bệnh phẩm.
  3. Chuẩn bị thuốc (mix) cho phản ứng Realtime PCR:

- Reverse transcriptase: Enzyme sao mã ngược, chuyển mạch RNA thành DNA.

- DNA Polymerase: enzyme tổng hợp các mạch DNA mới trên mạch khuôn DNA

- Mồi và probe như nêu ở trên mục 1

- Các thành phần khác: MgSO4, dNTPs, nước,… cần thiết cho quá trình tổng hợp mạch mới diễn ra. Các thành phần này thương được pha trộn sẵn, và đã được nhiều hãng trên thế giới thương mại hóa như: ThermoFisher, NewEngland BioLab,…

  1. Các đối chứng

- Chứng dương: quan trọng trong việc kiểm tra quá trình khuêch đại có thất bại hay không. Chứng dương được tách chiết RNA từ virus SARS-CoV-2 thực tế, hoặc trình tự nucleiotide được tổng hợp nhân tạo có độ tương đồng 100% so với virus thực tế. Ngày 07/02/2020, Việt Nam tuyên bố thành công trong việc phân lập được loại virus này trong phòng thí nghiệm [7]. Đây cũng là nguồn cung cấp chứng dương rất quan trọng cho các xét nghiệm dùng phương pháp Realtime PCR này.

- Chứng âm: để kiểm soát quá trình chạy có hay không việc nhiễm các tác nhân bên ngoài (nhiễm chéo), sự gắn đặc hiệu của mồi, probe lên vùng đích được xác định,…

- Ngoài ra còn có thêm chứng nội dùng kiểm soát quá trình thu mẫu và các bước trong quy trình thực hiện xét nghiệm.

Ngày 05/03/2020, Bộ KH-CN đã công bố kết quả nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm (bộ kit) phát hiện vi rút corona chủng mới (SARS-CoV-2) do Học viện Quân y và Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á thực hiện, và nhận được sự quan tâm lớn từ các đơn vị trong nước và quốc tế [6].

Ngày 13/03/2020, hai kít chuẩn đoán của 2 công ty hàng đầu thế giới về sinh học phân tử gồm Thermo Fisher và Roche đã được FDA chấp nhận đưa vào xét nghiệm COVID-19 và thương mại hóa [10].

Cho đến nay (ngày 05/06/2020) trên  thế giới có 287 kit phát hiện đã được thương mại hóa dùng phương pháp này, trong đó, 164 kit được cấp chứng nhận CE-IVD, 31 kit được FDA Hoa kỳ công nhận [9].

Như vậy, có thể thấy rằng phương pháp Realtime PCR đã và đang rất được quan tâm phát triển trên thế giới vì những đặc điểm ưu việt của nó như: Phát hiện chính xác với ngưỡng phát hiện thấp [4]. Tuy nhiên, phương pháp này không xác định được người nhiễm bệnh và người vừa mới khỏi bệnh khi mà các vật liệu di truyền của virus trong cơ thể vẫn chưa được đào thải/phân hủy hết (dương tính giả); ngoài ra, nó đòi hỏi phải có trang thiết bị, điều kiện phòng ốc nghiêm ngặt và nguồn nhân lực trình độ cao. Điều này hạn chế thời gian trả kết quả cũng như công tác ngăn chặn dịch lây lan nhất là ở các nơi như cảng hàng không; bến tàu, xe;… Bên cạnh đó, sự biến đổi trong bộ gen của virus diễn ra rất nhanh là nguyên nhân ảnh hưởng đến kết quả của phương pháp này.

  1. Phát hiện dựa trên phương pháp miễn dịch

Phương pháp miễn dịch trong xét nghiệm nhanh được biết đến rộng rãi với các ứng dụng như: Que thử thai, que thử HIV, … Hay xét nghiệm chẩn đoán HBV, HCV, … bằng phương pháp ELISA.

Nguyên tắc phát hiện dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể, một số cơ chất phát tín hiện được sử dụng để phát hiện có hay không sự kết hợp trên.

  • Kháng thể: Là hai lớp kháng thể IgM và IgG trong cơ thể người bị nhiễm SARS-CoV-2, kết quả nghiên cứu ban đầu được đăng trên tạp chí Nature từ một phụ nữ 47 tuổi ở Hồ Bắc, Trung Quốc cho thấy, hai lớp kháng thể này xuất hiện và tăng dần từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 20 sau khi bị nhiễm [5]. Một kết quả nghiên cứ khác của Quan-Xin Long và cộng sự (2020) cũng cho kết quả tương tự với 285 bệnh nhân bị nhiễm COVID-19[3].
  • Kháng nguyên: Là các protein của virus xâm nhập và kích thích sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể, sản xuất ra kháng thể chống lại virus đó. Trong nguyên tắc phát hiện bằng miễn dịch, việc sàng lọc kháng nguyên của virus gây đáp ứng miễn dịch  cơ thể vật chủ, cũng như sản xuất chúng với số lượng lớn là yếu tố quyết định đến hiệu quả của kit loại này.

(i) Kít phát hiện dựa trên kháng thể (IgG/IgM) xuất hiện trong có thể người bị nhiễm/đã nhiễm SARS-CoV-2: Phân lập kháng nguyên từ virus hoặc kháng nguyên được tạo ra bằng phương pháp tái tổ hợp có vai trò quyết định trong phương pháp này. Theo đó:

+ Kháng nguyên phân lập từ virus là tốt nhất cho độ chính xác của kết quả xét nghiệm, tuy nhiên việc phân lập/nuôi cấy virus để thu các phân đoạn kháng nguyên là khá nguy hiểm cho cả người thực hiện và cộng đồng nếu xảy ra sơ xót; phòng thí nghiệm dùng để phân lập/nuôi cấy virus đòi hỏi an toàn sinh học cấp III trở lên [11], các quy tắc trong phòng thí nghiệm rất nghiêm ngặt và người thực hiện yêu cầu trình độ chuyên môn, kỹ năng thực hiện rất cao; bên cạnh đó lượng kháng nguyên thu được từ phương thức này cũng tương đối thấp, thông thường sẽ được dùng trong quy mô phòng thí nghiệm chẳng hạn so sánh độ tương đồng của kháng nguyên trên virus và kháng nguyên tái tổ hợp tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gene.

+ Kháng nguyên được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gene (kháng nguyên tái tổ hợp). Với kỹ thuật này, một đoạn gene mã hóa cho protein là kháng nguyên của virus sẽ được chuyển vào và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn, nấm men, côn trùng, thực vật hay cả tế bào động vật. Vi khuẩn, hay nấm men là tế bào chủ ưa thích cho các nhà nghiên cứu để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp này vì đơn giản hơn, chi phí thấp, thời gian nhanh và sản lượng kháng nguyên tái tổ hợp thu được rất cao. Song, kháng nguyên tái tổ hợp cần phải qua các bước kiểm tra để đảm bảo tính tương đồng so với kháng nguyên hiện diện trên virus; sẽ tốn rất nhiều thời gian để thử nghiệm, sàng lọc lựa chọn những đoạn gene mã hóa cho kháng nguyên đặc hiệu nhất (không bị phát hiện chéo với bất kỳ virus/vi khuẩn/tế bào người/…), tối ưu hóa quy trình biểu hiện trong tế bào chủ và quy trình thu nhận, bảo quản chúng.

Trong chiến lược này, kháng nguyên sẽ được cố định trên giá thể (giếng – ELISA; vạch – que/strip test nhanh) huyết thanh người được xét nghiệm sẽ cho chảy qua, nếu có kháng thể IgM/IgG nó sẽ gắn đặc hiệu vào kháng nguyên được cố định trước giữ lại và cho tín hiệu thông qua các kháng thể thứ cấp (nếu có) và cơ chất phát tín hiệu. Tính đến ngày 05/06/2020, đã có 262 kit phát hiện dùng phương pháp phát hiện kháng thể IgM/IgG này; trong đó, 200 kit được cấp chứng nhận CE-IVD, và 11 kit được FDA Hoa Kỳ chấp nhận [9].

 

Hình 6: Một sản phẩm phát hiện nhanh SARS-CoV-2 dựa trên nguyên tắc phát hiện kháng thể

 

Hình 7: Các bước đơn giản thực hiện kit phát hiện nhanh và chỉ dẫn lâm sàng dựa trên nguyên tắc miễn dịch

Như đã đề cập trước đó, sự xuất hiện của kháng thể IgM/IgG sau khi nhiễm SARS-CoV-2 trên bệnh nhân là khá muộn (sau 7 ngày) và độ đặc hiệu của kháng nguyên kháng thể làm cho độ nhậy của các kit loại này không cao, thời gian phát hiện muộn. Các kit loại này thật sự phát huy tác dụng nếu dùng sàng lọc rộng rãi trong cộng đồng đặc biệt là nơi nghi nhiễm và vùng tâm dịch.

(ii) Kít phát hiện dựa trên kháng nguyên virus xuất hiện trong cơ thể người bị nhiễm: Kháng nguyên virus hay nói cách khác hơn là sự hiện diện của virus trong cơ thể người bị nhiễm, kháng nguyên virus sẽ không còn khi bệnh nhân đã khỏi bệnh. Trong chiến lược này, kháng thể sẽ được cố định trên giá thể (giếng – ELISA; vạch – que/strip test nhanh) huyết thanh người được xét nghiệm sẽ cho chảy qua, nếu có kháng nguyên virus nó sẽ bị các kháng thể đặc hiệu được cố định trước giữ lại và cho tín hiệu thông qua kháng thể  có chứa cơ chất phát tín hiệu. So với chiến lược phát hiện kháng thể thì thách thức chiến lược này là tạo ra được kháng thể để gắn đặc hiệu với kháng nguyên của virus. Có nhiều cách để tạo ra được kháng thể này chẳng hạn: từ huyết thanh người bệnh đã khỏi, kích thích đáp ứng miễn dịch trên động vật (chuột, thỏ,…) thu kháng thể (đa dòng) trong huyết thanh, tạo kháng thể đơn dòng,… trong đó kháng thể đơn dòng có độ đặc hiệu cao nhất. Về nguyên tắc, cách thức thực hiện cũng tương tự như chiến lược tìm kháng thể là có thể dùng phương pháp ELISA cũng như các que (strip) test nhanh, nhưng thời gian phát hiện sớm hơn [2]. Cho đến nay đã có 37 kít phát hiện loại này được thương mại hóa trong đó có 21 kít được cáp chứng nhận CE-IVD và 1 kít được FDA Hoa Kỳ phê duyệt [9].

Cho đến nay hiệu quả của kit phát hiện bằng phương pháp miễn dịch đã phát huy được hiệu quả nhất định đặc biệt là trong phát hiện nhanh SARS-CoV-2 góp phần công tác tầm soát và khống chế dịch kịp thời dịch bệnh lây lan trong cộng đồng. Về ưu điểm có thể nhận ra rằng, đây là kit sàng lọc cho kết quả nhanh (~10 phút), có thể phân loại nhanh được các cá nhân dương tính với SARS-CoV-2. Tuy nhiên, những hạn chế của kit này là, không thể phát hiện tác nhân trong giai đoạn mới nhiễm (cơ thể chưa hoặc có ít kháng thể dưới ngưỡng phát hiện), điều này làm tăng nguy cơ âm tính giả.

Tóm lại, các phương pháp đều có những đặc điểm vượt trội, và những mặc hạn chế của nó. Nếu kết hợp cả hai phương pháp khuếch đại nucleic acid (PCR/Realtime PCR, LAMP,..) và phương pháp miễn dịch nêu trên sẽ phát huy tối đa hiệu quả trong xét nghiệm sàng lọc và chẩn đoán tác nhân SARS-COV-2 nhằm ngăn chặn và đẩy lùi đại dịch COVID-19 vẫn còn đang tiềm ẩn nguy cơ trong nước và đang diễn biến phức tạp trên thế giới.

Nguyễn Hữu Duyên - P.QLKH&HTQT

Tài liệu tham khảo:

[1]       Laboratory testing for 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human cases: https://www.who.int/publications-detail/laboratory-testing-for-2019-novel-coronavirus-in-suspected-human-cases-20200117. Accessed: 2020-03-20.

[2]       Liu, I.-J., Chen, P.-J., Yeh, S.-H., Chiang, Y.-P., Huang, L.-M., Chang, M.-F., Chen, S.-Y., Yang, P.-C., Chang, S.-C., Wang, W.-K. and SARS Research Group of the National Taiwan University College of Medicine-National Taiwan University Hospital (2005), “Immunofluorescence assay for detection of the nucleocapsid antigen of the severe acute respiratory syndrome (SARS)-associated coronavirus in cells derived from throat wash samples of patients with SARS”, Journal of Clinical Microbiology, 43(5), 2444–2448.

[3]       Long, Q.-X. et al. (2020), “Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19”, Nature Medicine.

[4]       National laboratories: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance. Accessed: 2020-03-19.

[5]       Thevarajan, I., Nguyen, T.H.O., Koutsakos, M., Druce, J., Caly, L., Sandt, C.E. van de, Jia, X., Nicholson, S., Catton, M., Cowie, B., Tong, S.Y.C., Lewin, S.R. and Kedzierska, K. (2020), “Breadth of concomitant immune responses prior to patient recovery: a case report of non-severe COVID-19”, Nature Medicine, 1–3.

[6]       Việt Nam chế tạo bộ kit phát hiện SARS-CoV-2 công suất 10.000 bộ/ngày: (2020), https://thanhnien.vn/content/OTMxODI3.html. Accessed: 2020-03-20.

[7]       Việt Nam nuôi cấy và phân lập thành công virus corona mới: (2020), https://tuoitre.vn/news-20200206092010501.htm. Accessed: 2020-03-20.

[8]       Zhou, P. et al. (2020), “A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin”, Nature, 579(7798), 270–273.

[9]       SARS-CoV-2 diagnostic pipeline. FIND.

[10]     (2020), Thermo Fisher to produce millions of coronavirus diagnostic tests. STAT.

[11]     WHO-COVID-19-laboratory-2020.4-eng.pdf.